顯微鏡     

顯微鏡是一種光學儀器，主要用于將物體成像反射到人眼或視頻設備。最早的顯微鏡是由兩個組件制作而成的簡單顯微鏡，將肉眼所看不見的物體放大成像。在整個顯微鏡歷史中，其設計已從簡單的兩個組件發(fā)展成為由多個透鏡、濾光片、偏振片、 分光器、傳感器、照明源，以及一系列其他組件的組合構(gòu)成的精密顯微鏡。要深入了解這些復雜光學儀器，就必須先了解顯微鏡的組件、主要概念和規(guī)格及其應用。

顯微鏡組件

復合式顯微鏡是由多個透鏡的組合構(gòu)成的一種光學儀器。其工作原理與簡單放大鏡類似，那就是利用單片透鏡將微小物體放大成像，使人們能夠透過肉眼觀察到微小物體的微細結(jié)構(gòu)。簡單放大鏡的工作原理是將物體放置于單片透鏡的焦距內(nèi)，以此獲得該物體放大的虛像。中續(xù)透鏡系統(tǒng)在顯微鏡中取代了單片透鏡，轉(zhuǎn)而讓物鏡和目鏡協(xié)同工作，并根據(jù)應用的不同，將物體成像反射到人眼或傳感器中。顯微鏡中有兩個組件負責提高整體系統(tǒng)的放大倍率，這兩個組件是物鏡和目鏡。物鏡是最靠近物體的光學元件，其作用是得到物體放大的實像，并將其反射到目鏡。物鏡是顯微鏡最重要的部分，用于產(chǎn)生基線放大倍率。目鏡則是最靠近人眼或傳感器的光學元件，其作用是將物鏡所成的實像進一步放大，形成一虛像。目鏡的放大倍率通常為10倍，但有時會介于1到30倍之間。圖1展示了復合式顯微鏡的組件。另外，方程式1說明了顯微鏡整體系統(tǒng)放大倍率的計算方法。

圖1-復合式顯微鏡組件

目鏡

目鏡在顯微鏡發(fā)明之初扮演了重要角色，因為當時目鏡是唯一一個能夠讓人們透過肉眼觀察微小物體細節(jié)的光學元件。今天，人們是使用模擬相機或數(shù)碼相機，將物體成像反射到監(jiān)視器或屏幕上。顯微鏡目鏡通常是由場透鏡和目透鏡組合而成，具備多種設計，每種設計所提供的視場都比單片透鏡所產(chǎn)生的視場來得更大。要了解如何選擇合適的目鏡設計，請參閱選擇正確的目鏡。

照明

與選擇正確的目鏡或物鏡一樣，照明同樣也是顯微鏡中的重要部分。選擇正確照明對在實驗中獲得決定性的結(jié)論起了關(guān)鍵作用。在決定采用哪種類型的照明設置之前，首先要考慮的是應用設置、所要觀察的物體，以及預期的結(jié)果。

許多顯微鏡都會選擇采用背光源照明，而不是傳統(tǒng)的直接照明，因為后者通常會導致物體成像過度飽和。顯微鏡應用所采用的特定背光源照明類型為Koehler照明。在Koehler照明中，照明源（如燈泡）的入射光發(fā)射出充足光線，從后面照亮物體（圖2）。它配有兩種凸透鏡，那就是：聚光透鏡和集光透鏡。它的設計主要用于在物體平面和成像平面上提供亮度足夠且均勻的照明，讓物鏡得到的物體實像能夠通過目鏡進行反射。這是非常重要的，因為這能確保用戶不會將燈泡的燈絲放大成像。由于背光源照明是從后面照亮物體，因此這種現(xiàn)象亦稱為亮場照明。

圖2-Koehler照明設置

要采用亮場照明來觀察物體，就必須改變物體的不透明度。如果物體的不透明度沒有改變，照明源會在物體周圍產(chǎn)生模糊的黑點。最終得到的成像是部分物體和光源之間的相對反差。在大部分情況下，除非物體具有極高的透明度，否則只要有足夠的清晰度或分辨率，人們就能夠透過最終產(chǎn)生的成像看見物體的每個部分。當物體的透明度造成顯微鏡無法利用亮場照明來觀察物體的細節(jié)時，可以轉(zhuǎn)向采用暗場照明。

在采用暗場照明的顯微鏡中，光線無法直接進入物鏡，而是傾斜地照射在物體上。但要記住的重要一點是，光線仍然照亮著物體平面上的物體。暗場照明下所獲得的成像在透明物體和光源之間形成強烈明暗對比度。顯微鏡設置中的暗場照明所產(chǎn)生的光源會形成一束倒立的光線，阻擋光源的中央光束，從而使光改變途徑，傾斜地照射在物體上。圖3展示了暗場照明的設置，該空心圓錐光線就是物鏡的數(shù)值孔徑。相比較之下，亮場照明設置中沒有任何光線被阻擋。暗場照明的設計能夠讓光線照亮物體，但是卻無法進入光學系統(tǒng)，因此它適用于觀察透明物體。

圖3-暗場照明設置

微鏡使用的第三種照明類型是落射照明。落射照明的光束是在物鏡上方產(chǎn)生的。因此，物鏡和落射照明光源可用于代替Koehler照明設置。落射照明設計的最大優(yōu)勢在于利用物鏡來完成大部分的照明，因此它擁有緊湊的照明設計。圖4展示了常用于熒光應用中的落射照明設置。

圖4-落射照明設置

物鏡是顯微鏡結(jié)構(gòu)最為復雜的光學元件，由若干個透鏡組合而成的一個透鏡組，主要功能是使物體成一放大的實像。物鏡的放大倍率通常介于2到200倍之間。物鏡主要可以分為兩大類：傳統(tǒng)的折射物鏡和反射物鏡。每一大類進一步劃分為以下兩種類型：有限共軛和無限共軛（遠場校正）。要選擇最合適的物鏡，就必須了解每一大類物鏡及其個別類型的優(yōu)勢。

物鏡：折射式

折射物鏡是最常用于顯微鏡中的物鏡類別。當光線通過顯微鏡時，物鏡的折射式設計能讓光學元件將光線折射或彎曲。每個光學元件的表面都鍍有增透膜，其作用是減少背部反射，并改善整體光通量。折射物鏡常用于需要極高分辨率的機器視覺應用中。折射物鏡具有多種類型，每種類型都使用不同的光學配置。折射物鏡的設計范圍可以從配有兩個元件的消色差物鏡（元件分別為消色差透鏡和彎月透鏡），到配有十五個元件的平場復消色差物鏡（圖5）。平場復消色差物鏡是設計最為復雜的高端物鏡，物鏡本身能夠完成色差校正和平場校正。

圖5-復消色差物鏡（左）與消色差物鏡（右）設計

物鏡：反射式

反射物鏡是一種具有反射或鏡面設計的物鏡。盡管反射物鏡的大部分校正程度均與折射物鏡相同，但在選擇物鏡時，它依然常為人們所忽略。反射物鏡由第一和第二鏡像系統(tǒng)組合而成（圖6），其作用為將受觀察物體放大成像，然后將該成像反射到目鏡中。Edmund Optics®提供了各種不同設計的反射物鏡，其中最受歡迎的設計為Schwarzschild反射物鏡。由于光線是通過金屬表面進行反射，而不是通過玻璃表面進行折射，所以反射物鏡不具備如折射物鏡所面對的像差問題，因此無需采用額外設計來校正像差。另外，由于反射物鏡的表面主要材料為反射鏡膜而非玻璃基片，因此它能夠提供較高的光效以及為成像細節(jié)提供更高的分辨率。反射物鏡的另一優(yōu)勢是其工作距離長，比起傳統(tǒng)的折射物鏡，其所采用的鏡面能夠在紫外區(qū)域和紅外區(qū)域的光譜范圍內(nèi)工作。

圖6-剖析反射物鏡

主要概念和規(guī)格

物鏡主體上列出了大部分顯微鏡物鏡的規(guī)格，其中包括：物鏡設計/標準、放大倍率、數(shù)值孔徑、工作距離、透鏡-成像間距，以及蓋玻片厚度校正。圖7顯示了顯微鏡物鏡規(guī)格的相關(guān)說明。由于物鏡主體上已列出了所有規(guī)格，因此用戶在為某個應用安裝數(shù)個物鏡時，就可以輕易地了解到所使用物鏡的相關(guān)功能。對于如焦距、視場、波長設計等其他規(guī)格，用戶則可以輕易計算得出，或者向供應商或制造商索取有關(guān)規(guī)格。

物鏡標準

圖7-典型投射性顯微鏡物鏡

如果物鏡所采用的標準為簡單顯微鏡標準（如DIN或JIS標準），那么其主體就會列出系統(tǒng)所需的物鏡規(guī)格。大部分復合式顯微鏡設計標準均采用德國工業(yè)標準(Deutsche Industrie Norm，簡稱DIN)。DIN標準的顯微鏡物鏡法蘭和目鏡法蘭之間距離為160mm（圖8）。除了DIN標準外，同時也具備采用日本工業(yè)標準(Japanese Industrial Standard，簡稱JIS)的顯微鏡。JIS標準的顯微鏡物鏡法蘭和目鏡法蘭之間的距離為170mm（圖9）。在選擇合適物鏡和目鏡時，用戶必須將這兩個透鏡的法蘭距離考慮在內(nèi)，從而確保物鏡將物體放大成像后，正確地將該成像反射到目鏡中。雖然DIN標準和JIS標準的顯微鏡具有不同的成像距離，但是此距離差異并不會對顯微鏡的光學性能產(chǎn)生任何影響，并且都能夠提供相同高質(zhì)量的成像。另外，符合這兩項標準的顯微鏡均采用相同的0.7965" x 36TPI RMS安裝螺紋。

DIN和JIS標準長期以來一直是人們選擇經(jīng)典復合式顯微鏡時的考慮因素。一些顯微鏡制造商傾向于根據(jù)光學屬性來列出管透鏡長度，而非機械屬性。由于目鏡是在中間成像平面上使物體成像，因此這將改變DIN標準顯微鏡的管透鏡長度至150mm（圖8）。最后，用戶也可以通過物鏡特別列出的維度來了解管透鏡長度：齊焦距離(PD)。齊焦距離是物鏡法蘭和受觀察物體之間的距離。DIN物鏡的標準齊焦距離為45mm，而JIS物鏡的標準齊焦距離則為36mm（圖8和9）

圖8-DIN標準

圖9-JIS標準

目鏡和物鏡都具有放大倍率，對顯微鏡整體系統(tǒng)的放大倍率起著非常重要的作用。放大倍率通常是以一個數(shù)值和“X”表示。大部分物鏡的主體周圍都配有色碼環(huán)，用于表示物鏡的放大倍率（圖7）。舉例來說，黃色表示的放大倍率為10倍。

數(shù)值孔徑

物鏡的數(shù)值孔徑（NA)是焦距和入瞳直徑的函數(shù)。數(shù)值孔徑大的物鏡有時需要在受觀察物體和物鏡前端之間使用浸鏡油。這是因為空氣中能夠?qū)崿F(xiàn)的最高數(shù)值孔徑為1（相應光線角度為90°）。要獲得較大的角度并提高進入物鏡的光線數(shù)量（方程式2），就需要使用油浸物鏡（折射率通常為1.5）來改變受觀察物體和物鏡之間的折射率。數(shù)值孔徑大的物鏡和浸鏡油的結(jié)合使用提供了一個簡單的解決方案，使用戶無需花費更多的金錢來選擇使用其他物鏡。

視場代表著顯微鏡系統(tǒng)能夠觀察到物體的范圍。視場的大小是由物鏡的放大倍率來決定的。在配有目鏡和物鏡的顯微鏡系統(tǒng)中，其物鏡的視場是由目鏡放大的，從而使用戶能夠通過目鏡觀察到物體。然而，在相機物鏡系統(tǒng)中，視場則是傳遞到相機傳感器中。相機傳感器是矩形的，所以它只能接收到物鏡全視場中的部分成像。相比之下，人眼視網(wǎng)膜則可以看見全視場的整體成像。這就是為什么相機顯微鏡系統(tǒng)的視場通常都小于目鏡顯微鏡系統(tǒng)的視場。方程式3和4可用于計算上述系統(tǒng)的視場。

蓋玻片厚度

當使用顯微鏡觀察帶有液體的標本（如細菌、細胞培養(yǎng)物、血液等）時，應將這些組織或切片放在蓋玻片上，以免污染受觀察物體和顯微鏡組件。蓋玻片又稱為顯微鏡用蓋片玻璃，它能夠改變光線從物體到物鏡的折射。因此，要獲得高質(zhì)量的成像，就必須對物鏡進行正確的光學校正。這就是為什么備有一系列的蓋玻片厚度，以用于優(yōu)化物鏡。蓋玻片厚度通常是標識在無窮符號之后（即表示物鏡是有限共軛物鏡，或是遠場校正物鏡），厚度范圍介于0（無蓋玻片校正）至0.17mm之間。

像差校正

顯微鏡系統(tǒng)性能的高低取決于物鏡和目鏡的質(zhì)量。在選擇合適的物鏡類型時，除了放大倍率和設計復雜性之外，了解正確的像差校正也是極為重要的。像差校正（如消色差、復消色差、平場、半平場）是指物鏡本身能夠讓用戶輕易地看見物鏡的設計問題。色差校正通常可分為兩類：消色差和復消色差。消色差物鏡是結(jié)構(gòu)簡單且經(jīng)濟實用的一種物鏡。除了可校正綠色波長中的球差之外，它的設計主要用于校正紅色波長和藍色波長中的色差。但是，它無法消除其他波長的色差以及不具備平場校正的缺點導致其物鏡性能低下。相比之下，精密度高的復消色差物鏡則能夠在三種波長區(qū)域（紅色、藍色和黃色）中校正色差。此外，它們也能夠提供二到三種波長的球差校正，而且通常具有較高的數(shù)值孔徑和較長的工作距離。復消色差物鏡非常適合用于白光應用中，而消色差透鏡則是單色光應用的最佳選擇。然而，這兩種物鏡都具有一個顯著的缺點，那就是當物鏡放大倍率提高時，就會出現(xiàn)畸變和場曲問題。因此，在選擇物鏡時，應將整體顯微鏡系統(tǒng)性能考慮在內(nèi)，而并非只考慮到物鏡本身的性能。

平場物鏡，也稱為平面物鏡、半平場物鏡、半平面物鏡或微平面物鏡，都是用于校正場曲的物鏡。場曲是一種像差。當離軸成像無法在平坦的成像平面上集中時，光軸就會出現(xiàn)偏離，進而導致成像變得模糊。圖10展示了消色差物鏡、半平場物鏡和平場物鏡依據(jù)中心軸徑向距離計算得出的視場平坦度。使用消色差物鏡校正場曲之下，成像中心具有65%的平面視場。平場物鏡能夠提供更好的平場校正，使成像具有90%的平面視場。半平場物鏡的校正性能介于上述兩種物鏡之間，能夠使成像獲得80%的平面視場。

圖10-平場校正：消色差物鏡65%（左）、半平場物鏡80%（中）、平場物鏡90%（右）

螢石物鏡使用包含螢石或其他合成代替物的高級玻璃類型執(zhí)行進一步的像差校正。與消色差物鏡類似，螢石物鏡專為實現(xiàn)對紅色與藍色波長的色差修正而設計。但是，螢石物鏡的設計目的是針對兩或三個波長（而不僅僅是綠色波長）進行球面像差校正，通常具有更高的 NA，并具有更強的分辨能力和更高的對比度。

有限共軛

在有限共軛光學設計中，光源（不在無窮遠）是集中在一個點上（圖11）。受觀察物體在顯微鏡中是由物鏡放大成像的，然后物鏡會將成像反射到目鏡或傳感器（若使用相機）中。整個顯微鏡系統(tǒng)透鏡之間的距離是根據(jù)DIN或JIS標準而定的，所有有限共軛顯微鏡均采用其中一個標準。有限共軛物鏡普遍用于普通顯微鏡中。此外，有限共軛設計常用于成本和簡單設計為主要考量的應用中。

圖11- 簡單的有限共軛顯微鏡設計

無限共軛（遠場校正）

在無限共軛（又稱為遠場校正）光學設計中，位于無窮遠的光源是集中在一個小點上。該小點是物鏡中的受觀察物體，并且無窮遠朝向目鏡或相機的傳感器（圖12）。這種設計新穎的顯微鏡主要是利用物體和目鏡之間的額外管透鏡來產(chǎn)生成像。雖然此顯微鏡的結(jié)構(gòu)比有限共軛物鏡更為復雜，但是它卻允許用戶將濾光片、偏振片和分光器等光學組件裝入顯微鏡中。因此，額外的成像分析和外推能夠在此設計復雜的顯微鏡中執(zhí)行。舉例來說，在物鏡和管透鏡之間添加濾光片能讓用戶觀察到光源的特定波長，或是阻擋會對顯微鏡設置帶來干擾的多余波長。熒光顯微鏡應用就是采用這種設計類型。無限共軛設計的另一優(yōu)勢是其放大倍率能夠隨特定應用需求而變化。物鏡放大倍率是指管透鏡焦距與物鏡焦距之間的比率（方程式5），管透鏡焦距的增長或縮短都會改變物鏡的放大倍率。一般上，管透鏡是焦距為200mm的消色差透鏡，但是也可以采用其他焦距的透鏡，進而幫助定制顯微鏡系統(tǒng)的總放大倍率。如果所用物鏡為無線共軛物鏡，物鏡主體上會出現(xiàn)無窮遠符號。

圖12-簡單的無限共軛（遠場校正）顯微鏡設計

圖13-典型熒光顯微鏡設置